Les Boss sont des monstres puissants trouvés dans les salles de boss. Il est nécessaire de vaincre ces boss afin d'aller à l'étage suivant. Plus tard, les boss peuvent apparaître en tant qu'ennemis normaux. Le boss, pour un étage particulier, est choisi au hasard parmi tous les boss disponibles selon l'environnement. Les boss peuvent aussi apparaître en tant que champions, ce qui peut changer divers attributs comme la vie, les dégâts et les modèles d'attaques. Lorsqu'ils sont battus, la plupart des boss lâcheront un objet depuis la liste d'objet des Boss.
Les Boss sont plus résistants aux changements de statuts, par exemple il est plus difficile de les apeurer et le Night Light n'est pas capable des les ralentir.
De plus, la plupart des étages peuvent apparaitre avec une Salle contenant un Mini-Boss.
Les Boss Universels sont ceux pouvant apparaitre à la fin des étages 1-5 et 7, remplacant le Boss de l'environnement par le nouveau (ce qui change la liste de choix de l'Objet).
Les Sept Péchés Capitaux peuvent être rencontrés à chaque étage, et apparaîtront en tant qu’ennemis réguliers à partir de Womb/Utero. Contrairement aux autres boss, il n’y a aucune porte spéciale menant à eux, ce qui signifie que vous n’avez aucun moyen de savoir à l’avance si vous entrez dans une salle de mini-boss à moins que vous n'ayez en votre possession un objet révélant les salles spéciales sur la carte. Une fois dans la salle d’un mini boss, vous ne pouvez vous enfuir en bombant une porte, en effet elle sera barricadée et inviolable, sauf si vous utilisez une téléportation ou Dad’s Key.
Chacun des péchés possède des Consommables spécifiques lâchés ou des Objets (plus rarement).
Si une salle contient plusieurs mini-boss, uniquement le dernier tué laissera quelque chose, vous permettant ainsi de choisir quel genre d’objets ou consommables vous souhaitez.
Enfin, il existe également une variante Ultra de Pride et Greed. Ultra Pride ressemble à Edmund et Florian, tandis que Ultra Greed sert de Boss de fin au Greed Mode.
"A l’origine, chaque ennemi et boss devait ressembler à Isaac d’une manière ou d’une autre, ce qui est le cas pour la plupart d’entre eux."[1]
Les Salles de Boss Double Trouble peuvent contenir n'importe quel Boss des niveaux précédants et sont tous les deux la même version que ceux rencontré dans les étage précédants. Cela veut dire, par exemple, qu'une Salle de Boss Double Trouble dans The Caves peut contenir des Boss de The Cellar ou du Basement et que tous les combats Double Trouble dans The Caves peuvent aussi être rencontrés dans les Catacombes.
