Le mode Difficile change le gameplay par rapport au mode Normal d'une certaine manière pour le rendre plus difficile. Lorsqu'on joue en mode Difficile, un petit pentagramme rouge apparait sur le HUD, en dessous des consommables.
- Les salles contiennent des ennemis plus avancés et en plus grand nombre.
- Les champions se génèrent plus souvent; toutefois, ils accordent moins de consommables à leur mort.
- Vous êtes moins susceptible de recevoir des cœurs après avoir terminé une salle.
- Seuls les boss champions génèrent des cœurs rouges.
- Vous êtes plus susceptible d'être maudit à chaque étage.
- Vous êtes plus susceptible de recevoir la version difficile d'un étage (ex. Necropolis au lieu de The Depths)
Déblocages pour le mode Difficile
| Isaac | Magdalene | Cain | Judas | ??? | Eve | Samson | Azazel | Lazarus | Eden | The Lost | Modèle:AfterbirthLilith | Modèle:AfterbirthKeeper |  Apollyon
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|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Mom's Heart | ||||||||||||||
| Modèle:Afterbirth Toutes les marques d'achèvement |
Anecdotes
- Avant la version 1.03, la réduction du taux de génération affectait tous les consommables (non seulement les cœurs rouges).
- Les conditions de déblocage de Godhead sont augmentées dans le DLC Afterbirth à cause de l'ajout de nouvelles marques d'achèvement, mais il peut toujours être débloqué dans le jeu de base en utilisant la même méthode.
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